Leistungsangebot

Die Nutzer der Core Facility stimmen der Nutzungsordnung in ihrer aktuellen Form zu.

Planung

Bei der Planung durchflusszytometrischer Experimente sind eine Vielzahl von Faktoren zu bedenken:

  • Wie muss ich meine Probe aufarbeiten?
    (Enzymverdau, Dichtegradientenzentrifugation, Antikörperfärbung)
  • Welche Zellen außer meinen Zielzellen erwarte ich in meinem Zellgemisch?
  • Möchte ich analysieren oder auch sortieren?
    (nicht jedes Marker-Panel für die Analyse ist auch für den Sort geeignet)
  • Welche Marker muss ich bestimmen, um meine Population sicher zu definieren?
    (nach Stand der Forschung)
  • Welche Marker-Fluoreszenz-Kombination ist für meinen Versuchszweck optimal?
    (Markerexpression, Staining-Index, „Data spreading“)
  • Welche Kontrollfärbungen sind für meine Experimente essentiell?
    (Isotypkontrollen, „flourescence minus one“ (FMO) – Kontrolle, interne Kontrollen)

Zu all diesen Punkten bieten wir eine individuelle Beratung. Dadurch lassen sich von Anfang an Fehler vermeiden und somit Zeit und Kosten einsparen.

Probenvorbereitung

Nach individueller Absprache mit dem Nutzer der Core Facility und natürlich entsprechend unserer aktuellen Auslastung können wir folgende Punkte der Probenvorbereitung abdecken:

  • Gewinnung von PBMC aus humanem Blut
  • Dissoziation von Geweben
  • Färbung von Oberflächenmarkern
  • Färbung von intrazellulären Proteinen (Cytokine, Transkriptionsfaktoren)

In jedem Fall stellen wir allen Nutzern der Core Facility gern unsere Protokolle, SOPs und etablierten Panels zur Verfügung.

Sortierung

Für die Sortierung der Zielzellen wird auf die magnetische Zellsortierung nach der MACS-Technologie sowie auf die fluoreszenz-aktivierte Zellsortierung (FACSAria™IIIu) zurückgegriffen.

Welche Möglichkeiten diese beiden Geräte bieten, sind dem Abschnitt Ausstattung zu entnehmen.

Der autoMACS® Pro Separator ist für die individuelle Bedienung gut geeignet und kann nach einer kurzen Einweisung eigenständig benutzt werden. Im ZEMFO-Kalender können dafür Zeiten gebucht werden. Die Mitarbeiter der Core Facility kümmern sich um die regelmäßige Wartung des Gerätes und stehen bei Fragen zur Verfügung.

Die Bedienung des FACSAria™IIIu erfolgt durch die Mitarbeiter der Core Facility. Vom Nutzer und der Core Facility wird hierfür ein Sort-Protokoll ausgefüllt. Dies dient der Dokumention der abgegebenen Probe, des Sortverlaufs und der zurückerhaltenen Zellen. Der genaue organisatorische Ablauf kann selbstverständlich individuell vereinbart werden.

Einige Beispiele für Analysen und Zellsortierungen können unter Forschungsprojekte betrachtet werden.

Analyse

Für die grafische Auswertung steht der Core Facility die FACS Diva Software (Version 8.0.2) der Firma BD zur Verfügung, die von allen Nutzern verwendet werden kann.

Darüber hinaus besteht die Möglichkeit, größere Studien automatisiert mit der Statistiksoftware R und den passenden Bioconductor-Paketen für die Durchflusszytometrie auszuwerten. Ein Beispiel dazu kann hier gefunden werden.
Auch das neue openCyto-Framework zur datengetriebenen Gate-Setzung kann verwendet werden.

Einige Beispiele für Analysen und Zellsortierungen können unter Forschungsprojekte betrachtet werden.

Qualitätskontrolle und Dokumentation

CS&T und FACSComp

Für die durch die BD FACSDiva™ Software betriebenen Durchflusszytometer von BD bietet das BD™ Cytometer Setup & Tracking (CS&T) Tool eine einfache Möglichkeit, täglich die Zytometer-Performance zu überprüfen. Treten Abweichungen auf, können Geräteprobleme umgehend erkannt werden.
Halbjährlich wird eine Baseline aufgenommen, auf die der arbeitstägliche Performance Check zurückgerechnet wird. Auf diese Weise kann eine hohe Vergleichbarkeit der Daten über viele Monate hinweg gewährleistet werden.
Darüber hinaus bietet CS&T die Möglichkeit, automatisiert alle technischen Variablen optimal einzustellen, die für eine korrekte Analyse und Sortierung vonnöten sind (u.a. die PMT-Voltages, der Laser Delay und das Area Scaling).
Für das FACSCalibur™ stehen ebenfalls bead-basierte Methoden zur Verfügung, um die Leistung des Zytometers zu beurteilen. Unter Verwendung der entsprechenden Software BD FACSComp™ werden mithilfe der BD FACSCalibrite™ Beads wichtige Parameter des Zytometers, wie die Leistung der Laser, das Auflösungsvermögen und die Sensitivität der Detektoren oder das Time Delay gemessen. So wird das Gerät arbeitstäglich kalibriert und qualitätskontrolliert.

MiFlowCyt

Ein Konsortium internationaler Zytometrie-Gesellschaften hat einen Standard für die minimalen Informationen ausgearbeitet, die notwendig sind, um die experimentellen Details von durchflusszytometrischen Experimenten zu dokumentieren. Diese MIFlowCyt-Guidelines <http://flowcyt.sourceforge.net/miflowcyt/> sind die Grundlage für unsere Dokumentation. Ein Beispieldokument können Sie hier anschauen. Außerdem unterstützen wir die Nutzung des
öffentlichen FlowRepository, um die dokumentierten Daten der wissenschaftlichen Gemeinschaft zur Verfügung zu stellen.